Resolución de lípidos en células vivas: un nuevo avance en la microscopía fotoacústica hiperespectral del infrarrojo medio

Los lípidos no sólo son componentes estructurales de las membranas celulares y moléculas de almacenamiento de energía, sino que también están estrechamente relacionados con la aparición y desarrollo de cáncer, obesidad, diabetes, enfermedades cardiovasculares y enfermedades neurodegenerativas. Sin embargo, la observación directa y la distinción de diferentes tipos de lípidos en células vivas se han enfrentado durante mucho tiempo a desafíos técnicos. Los métodos tradicionales de etiquetado fluorescente están limitados por la eficiencia, la especificidad y la posible interferencia con las funciones celulares del etiquetado, mientras que las técnicas ópticas sin etiquetas a menudo tienen dificultades para distinguir las moléculas de lípidos con estructuras químicas similares.

Nature Methods ha publicado un estudio que presenta una tecnología llamada "Microscopía fotoacústica de región de huellas dactilares hiperespectral" (hyFOPM). Al utilizar los modos de vibración de enlace único en la región del infrarrojo medio de las huellas dactilares, esta tecnología permite la detección sin etiquetas y la obtención de imágenes dinámicas de esfingomielina (SM) y colesterol (Chol) en células vivas.

Principios técnicos
La mayoría de los métodos ópticos sin etiquetas se basan en señales en la región de vibración de estiramiento CH (aproximadamente 2800–3000 cm⁻¹), pero las bandas espectrales en esta región son muy similares en varios lípidos, lo que dificulta la distinción entre diferentes tipos. Por el contrario, la región de la huella digital del infrarrojo medio (900–1730 cm⁻¹) contiene más información de vibración de enlace simple que refleja la estructura única de las moléculas, como la absorción característica de enlaces amida, enlaces éster y anillos esteroides.

El diseño del sistema hyFOPM se centra en este concepto. Emplea un láser de cascada cuántico sintonizable como fuente de excitación, que cubre el rango de 900 a 2932 cm⁻¹ con una resolución espectral de 2 cm⁻¹. Los pulsos láser excitan la muestra para generar señales fotoacústicas, que son detectadas por un transductor ultrasónico para construir imágenes hiperespectrales. El sistema tiene una resolución espacial de aproximadamente 4,3 μm, lo que permite obtener imágenes al nivel de las células vivas.

Validación de modelos de lípidos
Para verificar la viabilidad de la tecnología, el equipo de investigación preparó primero modelos bidimensionales de soluciones lipídicas que contenían colesterol (Chol), fosfatidilcolina insaturada (DOPC) y esfingomielina (SM).

(1) Comparación de características espectrales

Los espectros de la región de huellas dactilares recopilados por hyFOPM son muy consistentes con los resultados de ATR-FTIR. Los tres lípidos exhiben picos espectrales distinguibles: el colesterol presenta un fuerte pico de absorción para la deformación del anillo esteroide a 1056 cm⁻¹; DOPC presenta vibración de estiramiento C=O del grupo éster a 1731 cm⁻¹; y la esfingomielina corresponde a la banda amida I, la banda amida II y la vibración de flexión del CH₂ del ácido graso a 1645 cm⁻¹, 1555 cm⁻¹ y 1464 cm⁻¹, respectivamente.

(2) Capacidad de clasificación y separación espectral
Cuando se utilizan solo 15 números de onda en la región de la huella dactilar para la desmezcla lineal, la diafonía entre el colesterol y la esfingomielina es cercana al 0%, mientras que la diafonía para DOPC es del 23%. Por el contrario, la diafonía aumenta significativamente cuando se utilizan 7 números de onda en la región de estiramiento CH. Una aplicación adicional del análisis discriminante lineal (LDA) muestra que la precisión de clasificación promedio alcanza el 96% cuando se usa la región de huellas dactilares o la región CH, y alcanza el 97% cuando se usan todos los números de onda.

(3) Modelos de vesícula unilaminar gigante (GUV)
El estudio preparó tres tipos de GUV para simular membranas celulares: el Modelo 1, una mezcla 1:1 de SM y Chol, que forma una membrana densa y ordenada; Modelo 2, una mezcla 2:2:1 de DOPC, SM y Chol, que coexisten en fases líquidas ordenadas y líquidas desordenadas; y el Modelo 3, DOPC puro, formando una membrana fluida desordenada. Las imágenes adquiridas por hyFOPM a 2852 cm⁻¹ son morfológicamente consistentes con las obtenidas mediante tinción fluorescente con rojo Nilo. Las características espectrales de diferentes vesículas corresponden a lípidos puros, lo que confirma que se pueden identificar componentes individuales en membranas mixtas.

(4) Aplicaciones de control de calidad
Al realizar mediciones espectrales en 10 GUV diferentes para cada tipo y trazar diagramas de fase ternarios, el equipo de investigación descubrió que la composición lipídica real se desviaba de la proporción objetivo (una discrepancia de aproximadamente el 40%). Esto indica que hyFOPM se puede utilizar para la evaluación de la calidad en la preparación de GUV.

Aplicaciones en células vivas
El estudio aplicó además hyFOPM a células vivas, observando los cambios dinámicos de la esfingomielina y el colesterol en dos modelos celulares, respectivamente.

(1) Acumulación de esfingomielina en células A549
Se trataron células de adenocarcinoma de pulmón humano (A549) con el compuesto antitumoral ácido 2-hidroxioleico (2-OHOA), que se espera que induzca la acumulación de esfingomielina. Se recogieron espectros de la región de huellas dactilares (1600–1400 cm⁻¹) de 50 células, lo que muestra que el área del pico de 1464 cm⁻¹ aumentó en un 117% después del tratamiento, en comparación con solo el 23% en el grupo de control durante el mismo período. Posteriormente, se realizaron imágenes en 3000 células utilizando solo cuatro números de onda (2852 cm⁻¹ para lípidos totales, 1540 cm⁻¹ para proteína amida II, 1464 cm⁻¹ para esfingomielina y 1048 cm⁻¹ para colesterol). Los resultados mostraron que la señal de esfingomielina continuó aumentando 48 y 72 horas después del tratamiento, mientras que la señal de colesterol no mostró cambios significativos.

(2) Carga de colesterol en células HEK
Se co-incubaron células de riñón embrionario humano (HEK293) con un complejo de metil-β-ciclodextrina-colesterol (MβCD-Chol) para aumentar el colesterol en la membrana celular. Los espectros de la región de huellas dactilares de 50 células mostraron que el área del pico de 1048 cm⁻¹ aumentó en un 161% después del tratamiento, mientras que el pico de 1464 cm⁻¹ para la esfingomielina disminuyó ligeramente, lo que es consistente con la propiedad conocida de que la ciclodextrina extrae algunos lípidos de la membrana mientras libera colesterol. Las imágenes con números de ondas múltiples de 3000 células confirmaron aún más la elevación de la señal del colesterol, con un ligero aumento en la señal de los lípidos totales y pocos cambios en la señal de las proteínas.

Importancia y perspectivas
Este estudio demuestra la capacidad de distinguir moléculas de lípidos con estructuras químicas similares en células vivas sin etiquetado. En comparación con los métodos tradicionales que se basan en el etiquetado fluorescente o isotópico, hyFOPM evita problemas como la eficiencia del etiquetado y la interferencia con las funciones celulares, y su selectividad se puede adaptar de manera flexible a las características espectrales de los lípidos objetivo ajustando los números de onda de excitación.

La especificidad espectral del sistema actual en la región de la huella digital es superior a la de la región de estiramiento CH, lo que abre posibilidades para distinguir más subtipos de lípidos. El estudio también señala que se espera que la combinación de técnicas avanzadas de separación espectral, como el aprendizaje profundo, mejore aún más la sensibilidad y la especificidad. Además, la microscopía fotoacústica de infrarrojo medio puede alcanzar una profundidad de imagen de más de 150 μm en tejido, y las aplicaciones futuras pueden extenderse a muestras gruesas o entornos in vivo. La aceleración tecnológica (p. ej., submuestreo espectral) y la miniaturización del sistema son direcciones importantes para hacer avanzar esta tecnología hacia el análisis en el punto de atención o las pruebas de laboratorio de rutina.